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四川农业大学王文明研究团队用Y1H技术揭示Osa-

发布时间:2022-01-19 13:47 作者:admin 来源:未知 点击: 字号:

      许多水稻 microRNA (miRNA) 已被确定为调节农艺性状和免疫的微调因子。其中,Osa-miR535靶向SQUAMOSA启动子结合蛋白14(OsSPL14)正向调节分蘖,负向调节产量和免疫力。
      2022 年1月8日四川农业大学王文明研究团队在The Plant Journal发表了一篇名为“Osa-miR535 targets SQUAMOSA promoter binding protein-like 4 to regulate blast disease resistance in rice”的文章揭示了Osa-miR535 靶向SQUAMOSA 启动子调控水稻稻瘟病抗性。
      在这里,我们发现Osa-miR535靶向另一个SPL基因OsSPL4,以抑制水稻对稻瘟病菌(M.oryzae)的免疫。Osa-miR535的过度表达显著降低了融合蛋白SPL4TB-YFP的积累,该融合蛋白包含OsSPL4中Osa-miR535的靶位点。一致地,Osa-miR535在3'非翻译区预测结合位点的第10和第11碱基对之间介导OsSPL4 mRNA的切割。过度表达OsSPL4(OXSP4)的转基因水稻表现出增强的稻瘟病抗性,同时增强了免疫应答,包括增加防御相关基因的表达和增加H2O2的积累。相反,敲除突变体osspl4表现出易感性。

4 OsSPL4增强抗米曲霉感染的免疫应答
SPL基因编码一类植物特异性转录因子,在拟南芥和水稻的发育和免疫中发挥重要作用,为了进一步确定Osa-miR535-OsSPL4模块调节的下游成分,我们通过在线工具进行了OsSPL4结合靶点筛选预测,发现GH3.2是候选基因之一。GH3.2编码一种吲哚-3-乙酸(IAA)-氨基合成酶,该合成酶在IAA稳态中起作用,并增强水稻对米曲霉的免疫力,数据表明,GH3.2可能在OsSPL4的下游发挥作用。
为了进一步研究OsSPL4是否与GH3.2启动子结合,我们使用酵母单杂交(Y1H)分析和双荧光素酶报告系统来评估OsSPL4蛋白在GH3.2启动子上的结合稳定性。如图6c所示,OsSPL4可以结合酵母细胞中的GH3.2启动子。此外,鉴定OsSPL4可增强由GH3.2启动子在烟草中表达的荧光素酶基因的表达(图6d)。然而,突变的OsSPL4蛋白中的结合被破坏,该蛋白缺乏含有SBP结构域(spl4δC)的C末端或突变的GH3.2启动子缺失GTAC核心基序(GH3.2m)(图6c),表明OsSPL4与GH3.2启动子结合,这依赖于SBP结构域和GTAC基序之间的识别。
然后,我们进行了EMSA来研究OsSPL4和GH3.2启动子之间的直接识别。将OsSPL4的SBP结构域与GST N端融合,从原核蛋白表达系统中表达并纯化融合蛋白。EMAS显示GST-sp4bp与覆盖GH3.2启动子GTAC核心基序的探针结合(图6e)。这种结合很大程度上被未标记的GH3.2前体阻断,但没有被突变的GH3.2启动子阻断,该启动子缺乏GTAC基序(GH3.2前体突变体)(图6e),这表明GH3.2启动子中的GTAC基序对OsSPL4的结合至关重要。有趣的是,OsSPL4不能与由OsSPL14结合的WRKY45启动子结合(图6e),但它正向调节WRKY45的表达。

6。OsSPL4与GH3.2的启动子结合以调节其表达
      EXPA基因编码细胞壁松弛扩展蛋白,导致细胞壁,即植物细胞的屏障,容易受到病原体的攻击。EXPA基因是IAA信号通路的下游成分,受GH3.2负调控。因此,我们询问了在GH3.2上游起作用的OsSPL4是否调节EXPA基因。在OsSPL4转基因品系中研究了EXPA家族基因的表达,并且EXPA1和EXPA5在OXSPL4品系中随着GH3.2的增加而显著降低(图S11和6b)。总之,这些数据表明GH3.2受OsSPL4调控,与Osa-miR535靶向的OsSPL14-WRKY45平行,用于调节水稻对米曲霉的免疫力(图7)。 

7 水稻免疫中Osa-MiR 535-OspL 4-GH 3.2模块的工作模型
      在本研究中,基于SPL基因在WT、OX535和MIM535中的表达模式,我们确定OsSPL4是Osa-miR535的另一个靶点,是水稻抗稻瘟病所必需的。进一步的机制研究发现了OsSPL4-GH3.2的通路。与OSAPL14-WRKY45平行,OSAPL14-WRKY45受Osa-miR535调节,参与水稻免疫。
文献链接:

https://doi.org/10.1111/tpj.15663
本文来源于微信公众号:植物科研

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