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NC | Cas12a基因编辑系统诱导DNA断裂后单链模板修复

发布时间:2021-11-25 08:45 作者:admin 来源:未知 点击: 字号:

      核酸酶靶向诱导DNA断裂与单链寡脱氧核苷酸(ssODN)修复模板结合使用是体内引入定向基因编辑最容易、通用和有效的方法之一。在CRISPR/Cas精准基因编辑中,单链寡脱氧核苷酸 (ssODN) 被广泛用作DNA修复模板。然而调控单链DNA模板修复(SSTR)的潜在机制尚不清楚,限制了人们对精准基因编辑的改进。近日,来自爱丁堡大学分子植物科学学院的Attila Molnar团队在Nature Communications 上发表了一篇名为Mechanistic and genetic basis of single-strand templated repair at Cas12a-induced DNA breaks in Chlamydomonas reinhardtii的文章。在这篇文章中,作者研究了真核生物莱茵衣藻中由CRISPR/Cas12a 诱导的DNA双链断裂(DSB)处的SSTR。
      为了探究SSTR,作者用之前开发的实验系统,通过CRISPR/Cas12a(以前称为Cpf1)核糖核蛋白(RNPs)靶向FK506-binding protein 12 (FKB12)基因座在体内诱导DNA双链断裂。FKB12的功能缺失会对雷帕霉素产生耐药性,作者将已知体积的细胞接种在含有及没有雷帕霉素的培养基上进行量化。基因编辑效率以雷帕霉素耐药菌落的百分比计算,称为‘fkb12法’。然后将ssODN与Cas12a RNP一起共转到细胞中。ssODNs包含一个24nt长的非同源中心区域,以取代guide RNA (gRNA) 靶向的基因组DNA序列,同时在FKB12的3个阅读框中引入终止密码子,其两侧有短的(<75 nt)同源序列。最后通过菌落PCR和Sanger测序检测耐雷帕霉素菌落中的插入和缺失。
      作者先检测ssODN同源序列长度对DNA编辑的影响,构建最佳的ssODN探究SSTR。发现长度为45个核苷酸(nt)时,SSTR呈指数增长。然后用30nt同源序列的ssODNs来检测SSTR的增加和减少。经过一系列实验最终证明单链DNA合并(ssDI)是莱茵衣藻中Cas12a诱导DNA双链断裂后单链DNA模板修复的主要方式。
      最后作者对参与DNA修复途径的SSTR进行遗传解析,发现表明莱茵衣藻和动物之间的SSTR存在差异,莱茵衣藻的SSTR在遗传上独立于rad51依赖性同源重组和FA(Fanconi anemia)途径,与NHEJ(non-homologous end-joining)途径拮抗,由alt-EJ (alternative end-joining)聚合酶θ介导。这一研究证明了莱茵衣藻作为模式生物研究核DNA修复的潜力。

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