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基因编辑服务

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详细介绍Detailed Introduction

植物基因编辑

背景介绍
       在2012年6月发表的论文中,两位科学家Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier带领的研究团队纯化了Cas9蛋白,发现它是双RNA引导的DNA内切酶,首次在体外证明使用Cas9的CRISPR系统可以切割任意DNA链,指岀CRISPR在活细胞中修改基因的能力。这是最早发表的把细菌天然免疫系统演变成CRISPR/Cas9基因编辑工具的工作。
       之后,因为简单、廉价和高效,CRISPR已经成为全球最为流行的基因编辑技术,被称为编辑基因的“魔剪”。科学家通过它可以高效、精确地改变、编辑或替换植物、动物甚至是人类身上的基因,经过改造的CRISPR技术被广泛地应用于农业和生物医药领域。
       许多动植物的重要性状和大约2/3的人类遗传病都是单核苷酸变异(SNP)引起的,对相关基因的研究就涉及到精准的单碱基编辑技术。目前精准的基因编辑技术主要包括以下几种:

单碱基编辑器(CBE和ABE)
       2016年4月,哈佛大学生物化学家David Liu实验室率先在Nature杂志上报告了一种新的基因编辑工具——单碱基编辑系统。单碱基编辑系统主要由sgRNA和融合蛋白两部分组成,其中融合蛋白由改造的Cas9蛋白(dCas9或nCas9)、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成。
       sgRNA通过与靶位点互补配对,引导融合蛋白结合到靶位点发挥作用。融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶能够使非互补链中相应的C经脱氨基作用转变为U,而DNA复制进一步使得U被T代替,而互补链上原来与C互补的碱基G将会变成A,而尿嘧啶糖基化酶抑制子则能够抑制U的切除,最终实现非互补链上的C替换为T和互补链上G替换为A的精确编辑(如下图)。该系统被称为胞嘧啶编辑器(CBE),实现C/G到T/A的转换。
       进一步地,通过定向进化法在大肠埃希菌中获得一个突变型的腺苷脱氨酶,可将DNA中的T转化为次黄嘌呤I,后者在DNA复制过程中可被识别为G,这样即可通过类似于CBE的机制实现靶序列中A/T到G/C的转换,该系统被称为腺嘌呤编辑器(ABE)(如下图)
       CBE和ABE系统的建立使单碱基编辑能实现4种形式的碱基转换,该系统不依赖于DNA双链断裂的产生,既规避了非同源性末端接合(NHEJ)修复途径的随机性,也摆脱了同源重组(HR)修复途径效率低的限制。

  CBE和ABE原理图

       目前,CBE和ABE系统经过不同程度的改造后,已经广泛应用于动植物基因功能研究和育种中。研究表明,同一编辑系统对不同靶点的编辑效率差异较大。对于生长发育必需基因,彻底敲除往往会造成植株死亡从而无法获得敲除突变体,而通过点突变的方式,可对基因进行构象的变化但是不会失活,给基因功能研究带来了更多的选择。

双碱基编辑系统
       CBE和ABE只能分别诱导产生C>T和A>G的点突变,有没有一种方法可以对于同一等位基因同时实现C>T和A>G的高效转换呢?2019年8月,日本东京大学Nozomu Yachie实验室首先开发了新的碱基编辑器——Target-ACE,原理很简单在nCas9蛋白上同时融合两种脱氨酶。随后,2020年1月13日,中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队和李家洋团队合作开发了一种内源基因突变碱基编辑器STEME,将胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶同时融合在nCas9的N端。研究表明,在水稻原生质体中,STEME-1在同一靶点进化。研究表明,在水稻原生质体中,STEME-1在同一靶点编辑胞嘧啶和腺嘌呤,C>T的诱导效率达61.61%,C>T和A>G同时突变的效率达15.50%。研究组利用STEME-1和STEME-NG对水稻OsACC基因实现了定向进化,获得了抗除草剂的定向突变植株。
       2020年6月1日,李大力和刘明耀课题组在Nature Biotechnology杂志发表了一种全新的双碱基编辑器——A&C-BEmax,通过密码子、核定位信号、linker序列以及UGI串联等多轮优化后,脱靶率显著降低、编辑窗口大幅拓宽以及编辑效率也得到了增加。该研究表明A&C-BEmax能高效地破坏胎儿期血红蛋白基因HBG1/2启动子区域转录抑制因子BCL11A结合位点(-114C>T或-115C>T)并同时创建新的转录激活因子GATA1的结合位点(-113A>G),说明了A&C-BEmax双碱基编辑系统对于精准治疗β-血红蛋白病具有巨大的潜力。
       与单碱基编辑器相比,双碱基编辑系统能实现60个额外的密码子的更改(18个氨基酸的替换),可以高效的同时实现A>G和C>T的精准替换,这无疑是给分子育种和基因治疗等研究上带来了巨大的应用潜能。

先导编辑器(Prime Editor,PE)
       PE基因编辑系统最先由David Liu实验室在2019年10月在Nature上发表,该系统的工作原理是sgRNA被改造成pegRNA(Prime editing guide RNA),pegRNA不仅包含引物结合位点(Primer binding site,PBS)区域,还携带着逆转录的模板序列,可以和逆转录酶(RT)相结合,实现将pegRNA的序列带入到目标基因序列中去。研究证明了该系统在人类细胞中可以引进12个点突变,实现范围是PAM上游3bp到下游29bp,插入达44bp,缺失达80bp。David Liu实验室目前对于PE系统有3个版本:PE1、PE2和PE3。三个版本的区别在于,PE2在PE1基础上对M-MLV逆转录酶进行了定向进化,提高了编辑效率。相比于PE1,PE2的点突变效率和碱基的增删效率提高了近2倍。对比于PE1/2,PE3系统则是在pegRNA下游附近,引入了一条与pegRNA方向相反的sgRNA,可以实现切割非互补链的目的,提高编辑效率。在293T细胞中,PE3系统的编辑效率可以达到78%。但是值得注意的是,由于是双链断裂,引入插入和缺失(indels)的风险会随之增加,因此该系统依然需要改进。
       PE系统目前已经在动植物中有多篇文章报道,但是其编辑效率普遍较低,还需要进一步的优化升级。
 

PE工作原理图

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可做物种及服务项目

实验交付内容
1、基因编辑载体质粒、一份大肠杆菌菌液;
2、检测测序结果;
3、实验报告(实验操作流程、基因编辑苗生物信息学解读结果);
4、对应数量的基因编辑苗、对照苗。

参考文献
Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016;533(7603):420-424.
Nishida K, Arazoe T, Yachie N, et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 2016;353(6305):aaf8729.
Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, et al. Publisher Correction: Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2018;559(7714):E8.
Sakata RC, Ishiguro S, Mori H, Tanaka M, Seki M, Masuyama N, Nishida K, Nishimasu H, Kondo A, Nureki OJb: A single CRISPR base editor to induce simultaneous C-to-T and A-to-G mutations. ResearchGate. 2019:729269.
Li C, Zhang R, Meng X, et al. Targeted, random mutagenesis of plant genes with dual cytosine and adenine base editors. Nat Biotechnol. 2020;38(7):875-882.
Zhang X, Zhu B, Chen L, et al. Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells. Nat Biotechnol. 2020;38(7):856-860.
Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576(7785):149-157.


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