拉下实验（Pull-down assay）
原理简介
拉下实验（Pull-down assay）是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外实验技术，近年来越来越受到广大研究者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。
适用场景
1、用于验证两个已知蛋白的相互作用；
2、筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
图 Pull-down验证蛋白互作原理图
实验流程
GST-诱饵蛋白原核表达载体构建/His-猎物蛋白原核表达载体构建—原核表达—蛋白纯化—Pull-down捕获猎物蛋白—SDS-PAGE电泳—Western blot或LC-MS/MS
实验周期
拉下实验（Pull-down）的优点
1、鉴定的蛋白是直接作用的蛋白，非间接作用的复合体；
2、GST标记可把一些难溶蛋白变成可溶蛋白，使实验变得更易操作；
3、GSH谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，洗脱纯度高。
2、GST标记可把一些难溶蛋白变成可溶蛋白，使实验变得更易操作；
3、GSH谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，洗脱纯度高。
拉下实验（Pull-down）的缺点
1、两个非同一定位的蛋白可能因电荷或是强亲和力的原因造成假阳性，需用其他方法再次验证，例如Co-IP等；
2、验证互作是在试管中进行的生化反应，不能够完全反映细胞内蛋白真实互作的状态；
3、融合表达的GST标签，肽链较长，可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。
客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式，提交项目所需要的具体信息：
1、探针基因和靶基因相关序列信息；
2、样品种属及类型；
3、如需进行特异性WB检测，客户需要提供特异性一抗；
4、尽可能丰富的相关资料、文献。
1、探针基因和靶基因相关序列信息；
2、样品种属及类型；
3、如需进行特异性WB检测，客户需要提供特异性一抗；
4、尽可能丰富的相关资料、文献。
实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。
交付结果
1、重组载体的全序列信息和注释信息；
2、重组载体的酶切图谱；
3、重组载体的测序结果；
4、重组载体：一份质粒、一份大肠杆菌菌液（25%甘油菌）；
(上述4点是客户需要构建载体，且客户自身需要才提供。)
5、实验图片：原始蛋白纯化考染图及WB结果图；
6、实验报告。
撰写文章时，该实验可引用以下参考文献
Vikis HG, Guan KL. Glutathione-S-transferase-fusion based assays for studying protein-protein interactions. Methods Mol Biol. 2004;261:175-186.
Sauer M, Delgadillo MO, Zouhar J, et al. MTV1 and MTV4 encode plant-specific ENTH and ARF GAP proteins that mediate clathrin-dependent trafficking of vacuolar cargo from the trans-Golgi network. Plant Cell. 2013;25(6):2217-2235.
Sauer M. MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. Bio Protoc. 2014, 4(12).
Valentino T, Palmieri D, Vitiello M, et al. PATZ1 interacts with p53 and regulates expression of p53-target genes enhancing apoptosis or cell survival based on the cellular context. Cell Death Dis. 2013;4(12):e963.
Zhang P, Wang R, Ju Q, et al. The R2R3-MYB Transcription Factor MYB49 Regulates Cadmium Accumulation. Plant Physiol. 2019;180(1):529-542.
徐重益. 植物中验证蛋白相互作用的Pull-down和Co-IP技术[J]. 植物学报, 2020, 55(1):7.
