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蛋白相关服务

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详细介绍Detailed Introduction

双分子荧光互补实验(BiFC)

原理简介
       Hu等在2002年最先报道了一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术——双分子荧光互补(Bimo-lecular fluorescence complementation,简称BiFC)。该技术巧妙地将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段(N-fragment、C-fragment),将这两个荧光蛋白的片段分别融合两个目标蛋白A、B,如果A与B蛋白发生了相互作用,在空间上互相靠近,就会重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子,在激发光的激发下,荧光蛋白发出荧光。反之,若A与B蛋白之间没有相互作用,则不能被激发岀荧光。

图 双分子荧光互补实验原理
注:A和B表示两个可以互作的蛋白。

       在绿色荧光蛋白GFP的基础上,也衍生出蓝色荧光蛋白BFP,青色荧光蛋白CFP和黄色荧光蛋白YFP等,这些荧光蛋白都可以用于BiFC实验。

 
图 使用BiFC实验检测SDEL1/2与SPX4之间的相互作用(Ruan et al., 2019)。

适用场景
1、验证蛋白质之间是否存在相互作用,可与酵母双杂、Co-IP等实验结果相互验证;
2、BiFC实验还能对细胞内蛋白相互作用的位置进行研究。

BiFC技术的优点
1、适用于体内和体外蛋白相互作用的验证;
2、实验中的蛋白处于天然状态,并能直观观察蛋白相互作用在细胞中的定位;
3、实验周期短;
4、相对于FRET和BRET技术对仪器的要求高、数据处理复杂的情况,BiFC只需要荧光倒置显微镜,数据处理简单,只检测荧光的有无,背景干净,检测更灵敏,不依赖于其他次级效应;
5、还可以用于研究蛋白之间的弱相互作用或瞬间相互作用;
6、不需要蛋白有特别的理论配比,能检测到不同亚群蛋白间的相互作用。

BiFC技术的缺点
1、对系统温度敏感,温度太高,片段不易互补形成完整的荧光蛋白。一般要求在30℃以下的实验环境,温度越低,越有利于片段的互补,这对研究细胞在生理条件下的蛋白相互作用不利;
2、观察至啲双分子荧光信号滞后于蛋白的相互作用过程,不能实时观察蛋白相互作用或蛋白复合物的形成过程。

实验流程
客户在线下单—订单/实验材料确认—全基因合成或者基因克隆(如果客户未提供测序完成的目标基因)—CloneCAD实验设计—BiFC载体构建—瞬时转化/激光共聚焦观察(可选项)

实验周期
1-2周

我司优势及特点
1、我司BiFC系统为改良的BiFC系统,降低了假阳性出现的概率;
2、增加了阳性对照系统,除了能够证明相互作用,也能证明其不相互作用。

客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录,请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式,提交项目所需要的具体信息,包括:
1、BiFC实验所需的质粒与序列相关信息;
2、尽可能丰富的相关资料、文献。

实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看网址。实验结题后,实验报告、检测结果可在线查看或打印,并永久保留。

实验交付内容
1、重组载体的全序列信息和注释信息;
2、重组载体的酶切图谱;
3、重组载体的测序结果;
4、重组载体:一份质粒、一份大肠杆菌菌液(25%甘油菌);
5、激光共聚焦拍摄的图片。

参考文献
Ruan W, Guo M, Wang X, et al. Two RING-Finger Ubiquitin E3 Ligases Regulate the Degradation of SPX4, An Internal Phosphate Sensor, for Phosphate Homeostasis and Signaling in Rice. Mol Plant. 2019;12(8):1060-1074.


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