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蛋白相关服务

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详细介绍Detailed Introduction

酵母双杂

原理简介
       Fields在1989年发明了酵母双杂交技术,打开了蛋白质相互作用筛选的快捷通道。这项技术的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究,GAL4包括两个结构域,即DNA结合结构域(DNA-binding domain,BD)和转录激活结构域(Activating domain,AD)。BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)并与结合,AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD分别单独作用并不能激活转录,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,转录启动子下游基因并使其表达。
       在酵母双杂交系统中,BD与X蛋白融合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,AD与BD会在空间上充分接近,重新构成结构域,启动报告基因的转录。拥有BD质粒的酵母可以在某一缺陷培养基上生长,拥有AD质粒的酵母菌可以在另一种缺陷培养基上生长,通过接合(mating)或共转化使酵母同时拥有AD与BD质粒。如果BD上的目的蛋白与AD上的诱饵蛋白存在相互作用,这样的酵母可以在三缺及四缺的培养基上生长,并启动β-半乳糖苷酶基因的转录。
 
图 酵母双杂原理

适用场景
1、高灵敏度地检测蛋白-蛋白的交互作用;
2、寻找在蛋白-蛋白交互作用中起关键作用的结构域或活性位点;
3、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白;
4、寻找具有药物治疗作用的小分子多肽;
5、寻找调控蛋白质相互作用的化合物;
6、绘制蛋白质相互作用图谱。

酵母双杂交技术的优点
1、无需纯化蛋白;
2、检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表体内的真实情况;
3、检测的结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用;
4、酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,并能分析细胞质、细胞核等多种亚细胞部位的蛋白。

酵母双杂交技术的缺点
1、酵母双杂并非对所有蛋白都适用,其检测的融合蛋白必须定位于核内才能激活报告基因,而融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内也是检测的前提条件,很多不能被转运到细胞核内的蛋白如胞质蛋白、膜蛋白不适用此方法;
2、假阳性较多。在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型:I型,表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录;II型,表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录;III,表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激活转录。因此,和酵母单杂交一样,为了得到更准确的结果,一般都要和其它的实验方法结合使用。这其中部分假阳性来源于筛选对象具有类似转录因子的功能,或在双杂交体系中能表现岀这种特性。部分假阳性原因不清,可能与宿主酵母细胞中其他蛋白质的作用有关。
3、在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白常会带来毒性作用,从而影响菌株生长及报告基因的表达;为抑制背景表达而在培养基中加入的3-AT(3-Amino Triazole)等物质也对菌株有一定的毒性,使得一些较弱的蛋白质间的相互作用呈现出假阴性结果。
4、虽然双杂交系统可筛选出大量相互作用的蛋白,但其中部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长发育的不同时期,生理状态下是不可能发生相互作用的。因此,对于筛选对象和范围,应有一个合适的选择。

点对点酵母双杂交验证实验流程
1、诱饵蛋白毒性及自激活检测;
2、共转化:分别将诱饵/捕获质粒(pGBKT7-Bait/pGADT7-Prey)、阳性对照质粒(pGBKT7-p53/pGADT7-T)、阴性对照质粒(pGBKT7-Lam/pGADT7-T)分别共转到Y2H Gold感受态细胞中,涂布于DDO平板培养;
3、点板验证:分别从平板上挑单克隆稀释10倍、100倍、1000倍,然后点板到TDO/X/A和QDO/X/A固体培养基进行验证;
4、实验数据与报告整理。

 实验周期
点对点酵母双杂交验证约30天

客户下单及项目信息填写
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1、BD与AD质粒及相关序列信息;
2、尽可能丰富的相关资料、文献。
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实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看网址。实验结题后,实验报告、检测结果可在线查看或打印,并永久保留。

实验交付内容


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