全国统一热线:400-027-0273 注册/登录

蛋白相关服务

.

详细介绍Detailed Introduction

酵母单杂

背景介绍
       酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来,在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用,同时也发现了新的DNA与蛋白质的相互作用,并由此找到了多种新的转录因子。酵母单杂交技术是一种研究蛋白质和特定DNA序列相互作用的技术方法。

原理简介
       真核生物基因的转录起始需转录因子参与,转录因子通常由一个DNA特异性结合域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活域组成,即DNA结合结构域(DNA—binding domain,BD)和转录激活结构域(Activating domain,AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子,GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS),而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFHD相互作用,提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中,DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此,我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因,只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用,同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶,启动下游报告基因的转录。

图 酵母单杂原理
       迄今为止,应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的DNA序列结合的蛋白质,同时单杂交技术还被应用于识别金属反应结合因子。正向与反向单杂交体系的结合,还可用于筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸。

适用场景
1、确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用;
2、分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;
3、定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域,以及准确定位与蛋白结合的核酸序列。

酵母单杂交技术的优点
1、酵母单杂交体系能在一个实验过程中识别与DNA特异结合的蛋白质,同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列,而无需分离纯化蛋白,实验简单易行。
2、由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质处于自然构象,克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点,因而具有很高的灵敏性。
3、目前,多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化,为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。

酵母单杂交技术的缺点
1、有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用,或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录,因此往往产生假阳性结果。
2、如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性,或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达,或融合蛋白发生错误折叠,或者不能定位于酵母细胞核内,以及融合的GAL4 AD封闭了蛋白质上与DNA相互作用的位点,则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶元件的能力,从而产生假阴性结果。
因此,为了得到较准确的结果一般都会和其它的验证方法一起结合使用。

酵母单杂交点对点验证的实验流程
1、pBait-AbAi质粒及Bait酵母菌株构建;
2、测试Bait菌株的AbAr表达水平,并确定最低AbA生长抑制浓度;
3、pGADT7-Prey质粒转化Bait菌株,并用高于最低AbA生长抑制浓度的AbA平板筛选;
4、实验数据与报告整理。

实验周期
酵母单杂交点对点验证约30天;酵母单杂交文库筛选约3个月

客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录,请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式,提交项目所需要的具体信息:
点击下单

对于酵母单杂点对点验证包括:
1、Bait质粒与Prey质粒相关序列信息;
2、尽可能丰富的相关资料、文献。

对于酵母单杂筛库包括:
1、Bait质粒与库的相关信息;
2、尽可能丰富的相关资料、文献。

实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看网址。实验结题后,实验报告、检测结果可在线查看或打印,并永久保留。

实验交付内容


如果您觉得本站还不错,就请分享给身边的好友吧

拨打电话